 یک فلوسایتومتر دارای مکنده
| |
| طبقه بندی | یاخته‌سنجی |
|---|---|
| نوع آنالیت | سلول و اجزای آن |
فلوسایتومتری (به انگلیسی: Flow cytometry) از روش‌های سلول‌شناسی یا یاخته‌سنجی است که به بررسی ویژگی‌های فیزیکی و شیمیایی سلول‌ها یا اجزای مختلف آن، ها می‌پردازد. به‌طور خلاصه، نمونه‌های سلولی، در مایعی مخصوص، غوطه‌ور شده و با تزریق این سوسپانسیون به دستگاه فلوسایتومتر، فرایند بررسی سلول‌ها توسط دستگاه آغاز می‌شود. اجزای متعدد سلولی را تعیین کرده و به صورت هم‌زمان آنها را مورد شمارش قرار می‌دهد. مواردی که توسط دستگاه فلوسایتومتر قابل اندازه‌گیری هستند عبارت‌اند از اندازه سلول، پیچیدگی سیتوپلاسمی، محتوای DNA و RNA سلول و محتوای طیف گسترده‌ای از پروتئین‌های داخل سلولی یا متصل به غشای سلولی. استفاده از این تکنیک در طول ۳۵ سال گذشته کاربردهای فراوانی پیدا کرده‌است.
مکانیسم
آنالیز کروموزومها با استفاده از فلوسایتومتری نیاز به دو منبع لیزر دارد. لیزر اول طوری تنظیم می‌شود که نور را در ۳۶۴ نانومتر برای تحریک رنگ فلورسنت 33285 Hoechst ساطع کند و لیزر دوم برای تحریک خاصیت فلورسانس Chromomvcin A3 نور را در ۲۵۸ نانومتر می‌تاباند. با استفاده از دو رنگ دارای خاصیت فلورسانس، سوسپانسیون کروموزوم‌های تثبیت شده رنگ‌آمیزی می‌شوند.
Hoechst 33258 تمایل بیشتری به دی‌ان‌ای غنی از AT دارد و chromomycin A3 به DNA غنی از GC متمایل تر است. هر یک از کروموزوم‌های رنگ شده در یک جریان مایع از مقابل منبع لیزر با سرعت ۲۰۰۰ کروموزوم بر ثانیه عبور می‌کنند. امواج فلورسنت ساطع شده از هر یک از کروموزومها اندازه‌گیری و ثبت می‌شود و پس از چند دقیقه چند صد هزار عدد در این مقادیر ثبت شده مربوط به هر یک از ۲۴ نوع کروموزوم انسانی جمع‌آوری شده و برای رسم یک نمودار، موسوم به فلوکاریوتایپ مورد استفاده قرار می‌گیرد. در این نمودار کروموزومها بر اساس محتویات دی‌ان‌ای و نسبت جفت بازی از یکدیگر تفکیک شده‌اند. نسبت جفت بازی براساس مقادیر نسبی امواج فلورسانس ساطع شده به وسیله دو رنگ فلورسنت متصل یافته به هر کروموزوم تعین می‌شود. در این نمودار دو محوری, هر یک از کروموزومها به صورت تجمعی نمایش داده شده‌اند که اگر یک خط قطری برای ابن نمودار ترسیم کنیم تجمعات بالای قطر کروموزوم‌های غنی از AT و تجمعات قرار گرفته در پایان قطر کروموزوم‌های غنی CG خواهند بود. به جز کروموزوم‌های ۹ تا ۱۲ که به دلیل داشتن محتویات بازی مشابه در یک تجمع قرار می‌گیرند، بقیه کروموزومها به صورت دسته جات متمایز از هم بر روی نمودار قابل مشاهده اند. جالب اینکه گاهی کروموزوم‌های همولوگ به جای قرار گرفتن در یک تجمع واحد در دو دسته قرار می‌گیرند. این حالت منعکس کننده تنوع در اندازه دو عضو یک جفت کروموزوم همولوگ به علت تنوع در اندازه هتروکروماتین آنهاست؛ بنابراین با این روش می‌توان تنوع مربوط به اندازه کروموزومها را که به دلایل مختلفی از جمله وجود نقایص کروموزومی ساختاری و هترومورفیسم رخ می‌دهد بررسی کرد. حد تفکیک حداقلی برای جدا کردن کروموزومها با این روش در حدود یک تا دو میلیون جفت باز است
روش FACS علاوه برشمارش، کروموزومها را از هم تفکیک کرده و آنها را در ظروف مجزایی قرار می‌دهد. این قابلیت حاصل توانایی این دستگاه در تبدیل جریان مایع کروموزومی به یک سری قطرات، که هر یک حاوی یک کروموزوم است، بوده و تفکیک این قطرات از هم بر مبنای بار الکتریکی آنهاست؛ زیرا هر قطره بر مبنای فلورسنتی کروموزوم درون آن، دارای مقدار بار مثبت یا منفی منحصر به فردی است. با عبور آنها از میان دو صفحه دارای ولتاژ، این قطرات متناسب با مقدار بار خود منحرف شده و هر یک درون یک ظرف خاصی فرود می‌آیند. از فلوسایتومتری برای تجزیه و تحلیل کاریوتیپ، نقشه‌برداری ژن و ساخت کتابخانه دی‌ان‌ای کروموزومی استفاده شده‌است. کروموزوم‌های تفکیک شده با این روش را می‌توان برای ایجاد کتابخانه دی‌ان‌ای مختص کروموزومی استفاده کرد. از این کتابخانه‌ها می‌توان در تهیه مواد لازم برای نقشه‌برداری کروموزومی و پروب‌های مختص کروموزومی بهره برد
در روش فلو سایتومتری سلول‌های رنگ آمیزی شده چه به وسیله آنتی‌بادی‌های مونوکلو نال متصل به فلورسنت و چه فلوروکرومهای متصل شونده به اجزای سلولی دریک جریان سیال قرار گرفته و به صورت تک تک از مقابل پرتو نوری (لیزر)عبور می‌کنند و متعاقب آن نور پراکنده شده و نور فلورسنس جانبی توسط آشکارسازها جمع‌آوری می‌شوند. این آشکارسازها سیگنالهای نوری را به سیگنالهای الکتریکی متناسب با نور جمع آوری شده تبدیل می‌کند. پراکنش نور در زاویه‌های مختلف می‌تواند سلول‌ها را بر اساس تفاوت در اندازه و پیچیدگی درونی از هم متمایز می‌کند در حالی که ساطع شدن نور از آنتی‌بادی‌های نشان دار شده با فلورسنت می‌تواند سلول‌ها را بر اساس تفاوت در آنتی‌ژن‌های سطحی و سیتو پلاسمی از هم تفکیک نماید. بدین ترتیب سلول‌ها بر اساس خصوصیاتی نظیر حجم گرانول‌شدن و میزان رنگ‌پذیری از هم قابل افتراق داده می‌شوند.
کاربردهای فلوسایتومتری
به‌طور کلی کاربردهای پزشکی فلو سایتومتری را می‌توان در چهار مورد خلاصه کرد.
- تشخیص و طبقه‌بندی سرطانهای خون.
- سنجش فاکتورهای بیولوژیکی و حضور بعضی مولکولهای اختصاصی که در تعیین پیش آگاهی بیماری نقش دارند.
- شناسایی آنتی‌ژن‌هایی که به عنوان هدف‌های درمانی استنفاده می‌شود.
- شناسایی سلول‌های باقی‌مانده بدخیم در طول درمان که در تعیین پاسخ به درمان و احتمال عود بیماری بسیار مهم هستند.
جستارهای وابسته
پانویس
خطای یادکرد: خطای یادکرد: برچسب <ref> برای گروهی به نام «persian-alpha» وجود دارد، اما برچسب <references group="persian-alpha"/> متناظر پیدا نشد. ().