واکنش زنجیره‌ای پلیمراز

واکنش زنجیره‌ای پلیمراز (به انگلیسی: polymerase chain reaction) که مخفف آن PCR می‌باشد، فنی در زیست‌شناسی مولکولی برای تکثیر یک نسخه منفرد یا نسخه‌های کمی از یک قطعه DNA با توالی خاص، به شمار هزار یا میلیون‌ها نسخه است. این فن ابزاری آسان و ارزان‌قیمت برای تکثیر یک تکه خاص از دی‌ان‌ای است و برای اهدافی همچون تشخیص و نظارت بر بیماری‌های ژنتیکی، شناسایی مجرمان (در زمینهٔ پزشکی قانونی) و مطالعه کارکرد یک بخش هدف از دی‌ان‌ای به‌کار می‌رود.

واکنش زنجیره‌ای پلیمراز

این فن در سال ۱۹۸۳ بوسیله کری مالیس ابداع شد. هم‌اکنون PCR یک تکنیک متداول و اغلب ضروری در آزمایشگاه‌های بالینی و آزمایشگاه‌های پژوهشی است و در موارد گوناگونی کاربرد دارد. این کاربردها شامل کلون‌کردن DNA برای توالی‌یابی، فیلوژنی بر پایه DNA، تحلیل کارکرد ژن‌ها، تشخیص بیماری‌های ارثی، شناسایی اثر انگشت ژنتیکی (مورد استفاده در علم پزشکی قانونی) و تشخیص عوامل بیماری‌زا در آزمایش‌های نوکلئیک اسید برای تشخیص بیماری‌های عفونی است. در سال ۱۹۹۳ مولیس همراه با مایکل اسمیت جایزه نوبل شیمی را برای کار روی PCR دریافت کردند.

اساس فن PCR چرخه‌های حرارتی است. این چرخه‌ها شامل چرخه‌های گرمایی و سرمایی تکراری، ذوب DNA و تکثیر آنزیمی DNA است. پرایمرها (قطعات کوتاه DNA) که دارای توالی مکمل ناحیه هدف‌اند به همراه یک DNA پلیمراز، اجزای اصلی واکنش PCR برای انتخاب و تکثیر قطعه مورد نظر را تشکیل می‌دهند. در فرایند PCR الگوی DNA به صورت لگاریتمی تکثیر می‌شود و DNA تکثیرشده خود به‌عنوان الگویی برای همانندسازی استفاده می‌شود. PCR می‌تواند به شکل گسترده‌ای برای انجام مراحل مختلف در دستکاری‌های ژنتیکی استفاده شود.

تقریباً در همه کاربردهای PCR از یک DNA پلیمراز مقاوم به حرارت مانند تک پلیمراز (آنزیمی که از باکتری Thermus aquaticus جداسازی شده) استفاده می‌شود. این DNA پلیمراز از یک DNAی تک‌رشته‌ای به عنوان الگو استفاده کرده و با کمک پرایمرها و با به‌کارگیری نوکلئوتیدها که بلوک‌های ساختاری DNA هستند، یک رشته DNAی جدید می‌سازد. در بیشتر روش‌های PCR از چرخه‌های حرارتی یعنی گرم و سردکردن متناوب نمونه‌های PCR بنابر مراحل دمایی مشخص استفاده می‌شود.

در مرحله نخست، دو رشتهٔ مارپیچ DNA دورشته‌ای در یک دمای بالا، در فرایندی که ذوب DNA نامیده می‌شود از یکدیگر جدا می‌شوند. در مرحله دوم، دما پایین آورده شده و و هریک از دورشته DNA به عنوان الگو عمل می‌کنند. ساخته‌شدن رشته جدید از روی الگو توسط DNA پلیمراز انجام می‌شود. پرایمرها بر اساس توالی قطعه‌ای از DNA که موردنظر ما است، طراحی می‌شوند.

اصول واکنش پی سی آر (PCR)

PCR یک ناحیه خاص از رشته DNA هدف را تکثیر می‌کند. به‌طور معمول بیشتر روش‌های PCR این قابلیت را دارند تا قطعات DNA بین ۱/۰ و ۱۰ کیلوجفت باز (kbp) را تکثیر کنند. هرچند فنون دیگر می‌توانند قطعاتی با اندازه‌های بالاتر از ۴۰ کیلوجفت باز را نیز تکثیر کنند. مقدار تکثیر محصول به‌وسیله سوبسترای موجود در واکنش که پیشرفت واکنش را محدود می‌کند تعیین می‌شود.

یک واکنش PCR پایه‌ای نیازمند چندین جزء است. این اجزاء شامل موارد زیر است:

• دی‌ان‌ای الگو که دارای ناحیه DNA هدف برای تکثیر است.
• تگ پلیمراز که یک DNA پلیمراز مقاوم به حرارت است.
• دو پرایمر DNA که مکمل انتهای ۳’ رشته‌های سنس و آنتی‌سنس DNA الگو هستند (بدون پرایمرها، جایگاه آغاز دورشته‌ای که DNA پلیمراز بتواند به آن متصل شود شناخته نمی‌شود). پرایمرهای خاصی که مکمل DNA هدف هستند از قبل انتخاب شده و به شکل سفارشی در آزمایشگاه ساخته یا از تأمین‌کنندگان خریداری می‌شوند.
• دزوکسی نوکلئوتیدهای سه فسفاته یا dNTPs بلوک‌های ساختاری هستند که DNA پلیمراز با استفاده از آن‌ها رشته‌های جدید را می‌سازد.
• یک محلول بافری که محیط شیمیایی مناسبی برای بهبود فعالیت و پایداری DNA پلیمراز فراهم می‌کند.
• کاتیون‌های دوظرفیتی مانند منیزیم (Mg) یا منگنز (Mn)؛ کاتیون Mg2+ متداول‌تر است. همچنین کاتیون Mn2+ می‌تواند برای جهش‌زایی DNA حاصل از PCR استفاده شود و غلظت بالای این یون نرخ خطا را در طول سنتز افزایش می‌دهد.
• کاتیون‌های تک ظرفیتی، معمولاً یون‌های پتاسیم (K)
• بافر 10X

واکنش معمولاً در حجم ۱۰ تا ۲۰۰ میکرولیتر در لوله‌های کوچک واکنش (با حجم ۲/۰–۵/۰ میلی لیتر) و در یک چرخه حرارتی انجام می‌شود. چرخه‌های حرارتی لوله‌های واکنش را به منظور فراهم کردن دمای لازم در هر مرحله سرد و گرم می‌کنند. بسیاری از چرخه‌های حرارتی پیشرفته از اثر پلتیر Peltier effect که اجازه گرم و سردکردن لوله‌های PCR را بوسیله معکوس کردن جریان الکتریکی می‌دهد؛ استفاده می‌کنند.

روش

به‌طور کلی PCR شامل مجموعه‌ای از ۴۰–۲۰ بار تغییر دمایی تکرارشونده به نام سیکل است که هر سیکل متداولاً از دو یا سه مرحله دمایی مستقل تشکیل شده‌است. مراحل مشترک اغلب روش‌های PCR عبارت است از:

نشانگر ژنتیکی یک جاندار با استفاده از واکنش‌زنجیره‌ای‌پلیمراز

1. آغاز: این مرحله برای DNA پلیمرازی که نیازمند فعال‌سازی گرمایی بوسیله Hot-start PCR است لازم می‌باشد و شامل گرم کردن محفظه واکنش تا دمای ۹۶–۹۴ درجه سانتی گراد (۲۰۵–۲۰۱ درجه فارنهایت) یا ۹۸ درجه سانتی گراد (۲۰۸ درجه فارنهایت) برای پلیمرازهای بسیار مقاوم به حرارت است. این مرحله ۱۰–۱ دقیقه به طول می‌انجامد.
2. دناتوراسیون: این مرحله نخستین مرحله سیکل است و شامل گرم‌کردن محفظه واکنش تا ۹۸–۹۴ درجه سانتی گراد (۲۰۸–۲۰۱ درجه فارنهایت) به مدت ۳۰–۲۰ ثانیه می‌شود که به‌وسیله شکستن پیوندهای دورشته‌ای بین بازهای مکمل باعث ذوب شدن یا دناتوراسیون DNA الگوی دورشته‌ای شده و به این ترتیب دو مولکول DNA تک رشته‌ای حاصل می‌شود.
3. اتصال: در این مرحله دمای واکنش به مدت ۴۰–۲۰ ثانیه به ۶۵–۵۰ درجه سانتی گراد کاهش می‌یابد که باعث می‌شود پرایمرها به هریک از الگوهای تک رشته DNA متصل شوند. اتصال معمولاً حدود ۵–۳ درجه سانتی گراد زیر دمای ذوب (Tm پرایمرها انجام می‌شود. در طول این فرایند DNA پلیمراز به ترکیبی از الگو و پرایمر متصل و شروع به ایجاد رشته‌های جدید می‌کند).
4. گسترش/ طویل شدن: در این مرحله دما برای عملکرد DNA پلیمراز لازم است؛ دمای بهینه یک DNA پلیمراز ۸۰–۷۵ درجه سانتی‌گراد است. با این وجود معمولاً دمای ۷۲ درجه سانتی‌گراد برای این آنزیم استفاده می‌شود). در این مرحله DNA پلیمراز یک رشته DNA ی جدید که مکمل رشته الگو است را در جهت ’۵ به ’۳ سنتز می‌کند. زمان لازم برای افزایش طول بستگی به DNA پلیمراز استفاده‌شده و طول ناحیه DNA هدف برای تکثیر دارد.

فرایندهای دناتوراسیون، اتصال و طویل شدن یک سیکل را تشکیل می‌دهند. برای تکثیر DNA هدف تا میلیون‌ها نسخه، سیکل‌های متعددی نیاز است.

1. طویل شدن نهایی: این تک مرحله اختیاری است و پس از آخرین سیکل PCR برای اطمینان از طویل شدن کامل هر تک رشته DNA در یک دمای ۷۴–۷۰ درجه سانتی گراد (۱۶۵–۱۵۸ درجه فارنهایت) به مدت ۱۵–۵ دقیقه انجام می‌شود.
2. نگهداری نهایی: مرحله نهایی سردکردن محفظه واکنش تا ۱۵–۴ درجه سانتی گراد برای یک زمان نامحدود است و ممکن است این مرحله برای ذخیره‌سازی کوتاه مدت محصولات PCR استفاده شود.

به منظور بررسی میزان موفقیت PCR انجام شده از الکتروفورز بر روی ژل (به منظور جداسازی محصولات PCR و بررسی اندازه قطعات استفاده می‌شود).

در طراحی پرایمر برای واکنش PCR باید نکات خاصی در نظر گرفته شود مثلاً حتماً بخش ۳پریم از پرایمر می‌بایست مکمل بخش هدف باشد که این برای بخش ۵ پریم الزامی نمی‌باشد همچنین باید در نظر گرفته شود که دو پرایمر حداقل توالی مکمل یکدیگر را داشته باشند و توالی‌های مستعد تشکیل سنجاق سری هم در آن‌ها تا حد معمول استفاده نشود. معمولاً از گرم‌کردن و سردکردن مخلوط واکنش برای جدا شدن دو رشته DNA و چسبیدن آغازگرها یا Annealing استفاده می‌شود. در نتیجه این چرخه‌ها میلیون‌ها نسخه از قطعه کوتاهی از DNA تولید می‌شود.

انواع روش های پی سی آر (PCR)

- ریل تایم پی سی آر (کمی (qPCR))

- پی سی آر In-silico

-  پی سی آر استاندارد (Conventional PCR) که شامل روش های زیر می باشد

1- پی سی آر ویژه آلل (Allele specific PCR (Tetra-primer ARMS PCR))

2- پی سی آر نامتقارن (Asymmetric PCR)

3- پی سی آر کلونی (Colony PCR)

4- پی سی آر دژنره (Degenerate PCR)

5- پی سی آر هات استارت (Hotstart PCR)

6- پی سی آر معکوس (Inverse PCR)

7- پی سی آر مینی پرایمر (Miniprimer PCR)

8- پی سی آر چندگانه (Multiplex PCR)

9- پی سی آر آشیانه (Nested)

10- پی سی آر تاچ داون (Touchdown)

11- پی سی آر رونویسی معکوس Reverse Transcription-PCR (RT- PCR)

12- پی سی آر AFLP

13- پی سی آر Alu

14- پی سی آر Assembly

15- پی سی آر ISSR

16- پی سی آر LATE

17- پی سی آر Long Range

18- پی سی آر Methylation-specific

19- پی سی آر rep

20- پی سی آر ARMS

21- پی سی آر Core sample

22- پی سی آر Dial-out

23- پی سی آر Digital

24- پی سی آر Droplet Digital

25- پی سی آر Ligation-mediated

26- پی سی آر Suicide

27- پی سی آر Helicase-dependent amplification

28- پی سی آر Multiplex Ligation-dependent Probe Amplification

29- پی سی آر TAIL

30- پی سی آر High Fidelity

31- پی سی آر GC-Rich

32- پی سی آر Nano

33- پی سی آر فاز جامد (SP-PCR)

جستارهای وابسته

• واکنش زنجیره‌ای پلیمراز بی‌درنگ
• واکنش زنجیره‌ای پلیمراز رونویسی معکوس

واکنش زنجیره پلیمراز (PCR) و مکانیسم آن. کتاب دانش سال راه رشد پروفسور سامان میسمی.

در ویکی‌انبار پرونده‌هایی دربارهٔ واکنش زنجیره‌ای پلیمراز موجود است.

پیوندها

• آموزش PCR

ویکی‌پدیای انگلیسی

• آنزیم پی سی آر امپلیکن بایگانی‌شده در ۱۷ اوت ۲۰۱۸ توسط Wayback Machine