سلول زدایی

اصول مهندسی بافت

سلول زدایی (به انگلیسی: Decellularization)، فرایندی است مورد استفاده در مهندسی زیست پزشکی که به منظور جداسازی ماتریکس برون یاخته ای از سلول‌های مستقر در یک بافت انجام می‌شود. این فرایند می‌تواند منجر به ایجاد داربست‌های طبیعی گردد که در ساخت اندام‌های مصنوعی و ترمیم بافت کاربرد دارد. پیوند اندام و بافت گسترهٔ بزرگی از چالش‌های پزشکی از نارسایی اعضای بدن تا جراحی‌های پلاستیک را برطرف می‌کند. یکی از مهم‌ترین محدودیت‌های مواجهه در پیوند عضو، رد پیوند به علت واکنش شکل گرفته بین پادتن‌‌های بدن گیرنده و آنتی‌ژن‌‌های موجود در سطح سلول‌های عضو پیوندی است. به دلیل پاسخ‌های ایمنی نامساعد، بیماران پیوندی ملزم به دریافت داروهای سرکوب گر سیستم ایمنی در تمام طول عمر می‌شوند. استفان ف. بادیلک(به انگلیسی: Stephen F. Badylak) بنیان‌گذار فرایند سلول زدایی درموسسهٔ مک گوآن بخش پزشکی بازساختی دانشگاه پیتسبورگ است. در طی این روند، زیست ماده ای طبیعی حاصل می‌گردد که می‌تواند به عنوان داربستی برای رشد و تمایز سلولی و نیز توسعه بافتی عمل کند. چنان چه به این داربست عاری از سلول، مجدداً سلول‌های خود بیمار وارد شود، پاسخ‌های ایمنی نامساعد به حداقل خود خواهد رسید. امروزه، داربست‌های ماتریکس برون یاخته ای در سراسر جهان به فروش می‌رسد.

با توجه به کاربرد گستردهٔ سلول زدایی در درمان، روش‌های شیمیایی، فیزیکی و آنزیمی به دقت به کار گرفته می‌شوند تا از صحت ساختاری و شیمیایی داربست‌ها و مطابقت آن با بافت اصلی اطمینان حاصل شود. محققان می‌توانند با استفاده از سلول‌های پیش ساز و سلول‌های بنیادی بالغ و تمایز دادن آن‌ها در داربست‌های ماتریکس برون یاخته ای، بافت و اندام موردنظرشان را ایجاد کنند و به بیمار پیوند بزنند. علی‌رغم آنتی‌ژن‌های سطح سلول، اجزای زیست شیمیایی موجود در ماتریکس برون یاخته ای میزبان‌های مختلف، یکسان بوده و پاسخ ایمنی چندانی را به همراه ندارد. تلاش برای حفظ ساختاری و شیمیایی فیبرها، فاکتورهای رشد و سایر پروتئین‌های ماتریکس برون یاخته ای در این فرایند، جهت تمایز موفق سلول‌های پیش ساز لازم است. موفقیت سلول زدایی بستگی به منشأ بافت اصلی، اجزا و چگالی آن دارد. در حال حاضر، این روش در ساخت داربست‌های زیستی برای بازسازی بافت‌های قلبی، پوستی، تنفسی، کلیوی و غیره حاضر است و ساخت کامل اندام هم در مراحل اولیهٔ پیشرفت می‌باشد.

طرح کلی روند سلول زدایی

محققین می‌توانند بافت موردنظرشان را از فرد اهداکننده یا جسد استخراج کنند. سپس سلول‌های موجود را بدون آسیب رساندن به ماتریکس برون یاخته ای از بین ببرند و در نهایت داربستی از جنس ماتریکس با همان کارایی فیزیکی و بیوشیمیایی بافت اصلی بسازند. می‌توان سلول های بنیادی و پیش ساز فرد میزبان را وارد این داربست کرد تا به سلول‌های اصلی تمایز یابند. از آن جایی که آنتی ژن‌های سلولی فرد اهداکننده با حذف سلول‌ها از بین رفته اند، پاسخ ایمنی در بدن گیرنده ناچیز است. این فرآیند همچنان در حال تکامل است. به دلیل تفاوت‌ها و کاربردهای متنوع بافت‌ها در بدن، تکنیک‌های مورد استفاده برای هر بافت اختصاصی است. سلول زدایی، می‌تواند روند فیزیکی، شیمیایی یا آنزیمی را داشته باشد. اگرچه ممکن است یکی از این روش‌ها بیشتر استفاده شود، اما کاربرد و منشا بافت است که تعیین می‌کند چه ترکیبی از متدها کارساز است.

در مواجهه با محلول‌های شیمیایی و آنزیم‌ها، دو تکنیک وجود دارد. تکنیک تزریق داخل رگی(به انگلیسی: Perfusion) مخصوص بافت‌هایی با سیستم خون رسانی و رگی گسترده نظیر قلب و ریه است. لازم است که سلول‌ها در تمام عمق‌های بافتی از بین بروند. بنابراین می‌توان مواد شیمیایی و آنزیم‌های مخرب سلولی را داخل رگ تزریق کرد تا تحت این مکانیسم و شرایط فیزیولوژیک مناسب، از رگ به بیرون منتشر شوند و به‌طور یکسان به تمام نقاط بافت بروند که در نهایت از طریق وریدهای موجود از بافت خارج می‌شوند. تکنیک بعدی، سلول زدایی با غوطه ور سازی (به انگلیسی: Immersion) است که طی آن بافت را به‌طور کامل وارد محلول شیمیایی و آنزیمی میکنند. اگرچه این تکنیک آسان تر است اما مختص بافت‌های نازک با سیستم خون رسانی ضعیف می‌باشد .

روش های فیزیکی

متداول‌ترین روش‌های فیزیکی برای حذف و مرگ سلول‌ها استفاده از دما، نیرو، فشار و الکتریسیته است. روش‌های دمایی عمدتا بر اساس مکانیسم انجماد و ذوب سریع می‌باشد . با انجماد سریع بافت، کریستال‌های یخی میکروسکوپی اطراف غشای پلاسمایی تشکیل گشته که منجر به لیز سلول می‌گردد. سپس بافت در معرض محلول‌های شیمیایی قرار می‌گیرد تا اجزای زائد و نامطلوب از آن پاکسازی شود. این روش اگرچه باعث حفظ ساختار فیزیکی داربست ماتریکس برون یاخته ای می‌شود اما بهترین نتیجه را در بافت‌های ضخیم و قوی می‌دهد.

فشارهیدواستاتیک کنترل شده ناشی از اعمال نیرو به‌طور حتم باعث خرابی ساختار ماتریکس برون یاخته ای خواهد شد. این روش برای کارایی بهتر باید در دمای بالا انجام شود تا از تشکیل کریستال‌های یخی کنترل نشده و تخریب بافت، اجتناب شود. هم چنین می‌توان بافت را در معرض پالس الکتریکی قرار داد تا منافذ میکروسکوپی در غشای پلاسمایی سلول‌ها ایجاد شود که سرانجام سلول‌ها بر اثر به هم ریختن تعادل همئوستاتیک از بین می‌روند. این فرآیند،الکتروپوریشن غیرقابل بازگشت غیردمایی (به انگلیسی: Non-thermal irreversible electroporation (NTIRE)) نامیده می‌شود و کاربردش محدود به بافت‌های نازک است. در شرایط درون جانداری (in vivo) نیز اعمال جریان الکتریکی با محدودیت مواجه است.

روش های شیمیایی

ترکیب صحیحی از مواد شیمیایی جهت سلول زدایی با توجه به ضخامت بافت، ترکیب ماتریکس برون یاخته ای و هدف اندام یا بافت انتخاب می‌شود. برای مثال، از آنزیم‌ها نمی‌توان در بافت‌های کلاژن دار استفاده کرد چرا که باعث از بین رفتن فیبرهای بافت همبند می‌شوند. با این حال، اگر میزان کلاژن بالا نباشد یا وجودش اهمیتی نداشته باشد، آنزیم کاربرد خواهد داشت. مواد شیمیایی مورد استفاده در سلول زدایی شامل شوینده‌های یونی،غیریونی و زویتریون است.

سدیم دودسیل سولفات به اختصار SDS با فرمول CH₃(CH₂)₁₁SO₄ Na، شویندهٔ یونی پرکاربردی است که تأثیر به سزایی در لیزسلولی بدون وارد کردن آسیب چندان به ماتریکس دارد. مکانیسم کارش به این شکل است که ابتدا این شوینده  غشای سلولی را تخریب می‌کند. سپس اندونوکلئازها و اگزونوکلئازها محتوای ژنتیکی سلول‌ها را از بین می‌برند و سایر اجزای سلولی هم حل شده و از ماتریکس شسته می‌شوند. آلکالین و مواد اسیدی بهترین همراه برای SDS هستند زیرا توانایی تخریب اسیدهای نوکلئیک و حل کردن محتویات سیتوپلاسمی را در خود دارند.

تریتون ایکس-100(به انگلیسی: Triton X-100) و به فرمول (C₁₄H₂₂O(C₂H₄O)_n معروف‌ترین شویندهٔ غیر یونی است که در سلول زدایی هم کاربرد گسترده ای دارد. این شوینده قادر است برهمکنش بین لیپیدها و بین لیپیدها و پروتئین‌ها را از بین ببرد. اما تأثیری در برهم کنش بین پروتئین‌ها ندارد که برای حفظ ساختار ماتریکس برون یاخته ای مفید است.

اتیلن دی آمین تترا استیک اسید به اختصار EDTA و به فرمول C₁₀H₁₆N₂O₈ عاملی چنگالنده (به انگلیسی: chelating agent) است یعنی می‌تواند بااتصال به یک یون فلزی، ساختار حلقه ای پایدارتر تشکیل دهد. این ماده به یون کلسیم، عنصر لازم برای برهم کنش بین پروتئین‌ها، متصل می‌گردد و آن را از دسترس خارج می‌کند و بدین ترتیب پروتئین های سراسری وابسته به کلسیم که در اتصالات بین سلولی شرکت می‌کنند، از کار می افتند. EDTA اغلب با تریپسین در سلول زدایی اسفاده می‌شود. تریپسین پروتئازی است که پیوند موجود بین پروتئین‌های سراسری سلول‌ها و اتصال سلولی را از بین می‌برد.

روش های آنزیمی

آنزیم‌های مورد استفاده در سلول زدایی به منظور شکستن پیوندها و برهم کنش‌های موجود بین اسیدهای نوکلئیک، سلول ها(از طریق پروتئین‌های سراسری)، و سایر اجزای سلولی می‌باشند. لیپازها، ترمولیزین، گالاکتوزیدازها، نوکلئازها و تریپسین همگی به کار گرفته می‌شوند. بعد از این که لیز سلولی بر اثر شوینده‌ها، اسید، فشار فیزیکی و ... اتفاق افتاد، اندونوکلئاز و اگزونوکلئازها وارد عمل می‌شوند تا محتویات ژنتیکی را از بین ببرند. اندونوکلئازها، DNA و RNA را در وسط توالی شان برش میزنند. بنزوناز (به انگلیسی: Benzonase) اندونوکلئازی است که می‌تواند قطعات کوچک نوکلئوتیدی متعددی تولید کند که در ادامه از ماتریکس حذف می‌شوند. اگزونوکلئازها پیوند فسفو دی استر را از انتهای توالی DNA از بین میبرند و قطعه ای از انتها به دست می آید.

تریپسین، پروتئازی است که برهم کنش بین پروتئین‌ها را تخریب می‌کند. اگرچه تریپسین می‌تواند تأثیر نامطلوبی روی فیبرهای کلاژن و الاستین ماتریکس خارج سلولی داشته باشد،اما استفاده از آن به شیوهٔ حساس به زمان، خرابی‌های ممکن را کنترل می‌کند. آنزیم دیسپاز(به انگلیسی: Dispase) جهت جلوگیری از تجمع سلولی به کار گرفته می‌شود که برای جداسازی سلول‌ها از ماتریکس برون یاخته ای مفید است. آزمایش‌ها نشان داده‌اند که دیسپاز، مناسب سطح بافت‌های با ضخامت کم است مانند ریه . برای حذف سلول‌های عمقی تر، تحریک  مکانیکی هم باید وارد روند گردد.

کلاژناز تنها زمانی استفاده می‌شود که برایمان مهم نباشد داربست نهایی، ساختار کلاژنی سالم داشته باشد. لیپازها عمدتا زمانی کاربرد دارند که به پیوند پوست فاقد سلول نیاز باشد. اسید لیپازها سلول زدایی بافت درمی را از طریق تجزیهٔ لیپید و از بین بردن برهم کنش بین سلول‌های غنی از لیپید انجام می‌دهند. آنزیم آلفا-گالاکتوزیداز هم موجب حذف اپی توپ گال که مربوط به آنتی ژن ساختارهای دارای کربوهیدرات بر سطح سلول است، می شود.

کاربردها

داربست‌های طبیعی که از جنس ماتریکس خارج سلولی هستند و طی سلول زدایی بافتی حاصل می‌گردند، محیط فیزیکی و زیست شیمیایی لازم جهت تسهیل رشد و تمایز سلول‌های پیش ساز و بنیادی را فراهم می‌کنند. این داربست‌ها، در هر دو شرایط درون آزمایشگاهی(in vitro) و درون جانداری(in vivo) به دست آمده‌اند. کارآمدترین بافت‌های سلول زدا شده مربوط به بافت‌هایی می‌باشد که سلول‌ها عمدتا دستخوش تقسیمات متقارن می‌گردند و تمایز چندانی وجود ندارد نظیر استخوان و پیوندهای درمی. با این حال، تحقیقات در حد مرحلهٔ تولید اندام در حال پیشرفت است.

ماتریکس‌های بدون سلول درمی کاربردهای زیادی پیدا کرده‌اند. برای مثال،پیوند های پوستی در جراحی‌های پلاستیک و درمان سوختگی استفاده می‌شود که علاوه بر حمایت فیزیکی ناحیهٔ آسیب دیده، موجب برانگیختن توسعهٔ بافت همبند پیوندی نیز می‌شود. در قلب نیز، شاهد موفقیت در خصوص ایجاد دریچه‌های سالم قلبی از ماتریکس‌های طبیعی بوده ایم. در تکنیکی به نام ROSS از ماتریکس بدون سلول دریچه استفاده می‌شود و به تدریج سلول‌های محلی به آن مهاجرت کرده و دریچه دارایی کارایی سابق می‌گردد. هم چنین آلوگرافت‌های بدون سلول نقش مهمی را در بازسازی و ترمیم استخوان‌های معیوب ایفا می‌کنند.

محدودیت‌های مهندسی بافت میوکارد قلبی از آن جا ناشی می‌شود که باید خون رسانی و پیوند به بدن بیمار با سرعت انجام شود. با اینکه داربست ماتریکس برون یاخته ای، پروتئین‌ها و فاکتورهای رشد بافت اصلی را در خود دارد اما کنترل اختصاصیت بافت قلبی در مرحلهٔ مولکولی میسر نشده‌است. تحقیقات مربوط به ریه، در خصوص سول زدایی کل اندام و استفاده از آن به عنوان داربست با موفقیت بیشتری همراه بوده‌است. محققین توانسته‌اند کل شش موش صحرایی را با روش پرفیوژن سلول زدایی کنند. سپس سلول‌های بنیادی جنینی همان موش را وارد اندام فاقد سلول کردند. شش ساخته شده در آزمایشگاه، با پیوند به بدن موش، شروع به فعالیت کرد.

موفقیت‌های دیگر در این زمینه در خصوص بافت زیرمخاطی روده کوچک، کلیه، کبد و پانکراس است. بافت زیرمخاطی روده کوچک ضخامت کمی داشته و از طریق تکنیک غوطه ور سازی در محلول‌های شیمیایی سلول زدایی می‌شود. تحقیقات دربارهٔ بافت کلیوی همچنان در حال انجام بوده اما نتایج خوبی مشاهده شده‌است. مهندسی بافت پانکراس ثابت کرده که هر بافتی در سطح مولکولی اختصاصیت دارد. تا الان دانشمندان نتوانسته‌اند کل اندام پانکراس را در آزمایشگاه بسازند اما در تولید اندامی که در بخش‌هایی کارایی دارد موفق بوده‌اند. برای مثال، موش‌های دیابتی در نقاط خاصی از پانکراس شان ماتریکس بدون سلول را دریافت کرده و بهبود علائم داشتند.

سلول زدایی امروزه منبع امیدی برای پزشکی بازساختی تلقی شده و کابردهای زیادی از ماتریکس‌های فاقد سلول در حال کشف شدن می‌باشد .       

پانویس

در ویکی‌انبار پرونده‌هایی دربارهٔ سلول زدایی موجود است.

• واژه‌های مصوب فرهنگستان زبان و ادب فارسی
• پایگاه اطلاع رسانی سلول های بنیادی ایران